DB22／T 396.10-2017保健用品毒理学评价程序与检验方法 第10部分：致畸试验.pdf

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1、 ICS 11.020 C 05 DB22 吉林省地方标准 DB 22/T 396.102017 代替 DB22/T 396-2014保健用品毒理学评价程序与检验方法 第 10 部分:致畸试验 Toxicological evaluation procedures and test methods for health care products Part 10: Teratogenicity test 2017 - 11 - 10 发布 2017 - 12 - 30 实施吉林省质量技术监督局 发 布 DB22/T 396.102017 I 前 言 DB22/T 396保健用品毒理学评价程序与

2、检验方法拟分为如下部分： 第 1 部分：评价程序； 第 2 部分：急性经皮毒性试验； 第 3 部分：长期经皮毒性试验； 第 4 部分：皮肤刺激性试验； 第 5 部分：皮肤变态反应试验； 第 6 部分：细菌回复突变试验； 第 7 部分：啮齿动物微核试验； 第 8 部分：小鼠精子畸形试验； 第 9 部分：哺乳动物培养细胞染色体畸变试验； 第 10 部分：致畸试验； 第 11 部分：致癌试验； 第 12 部分：人体皮肤斑贴试验。 本部分为DB22/T 396-2017的第10部分。 本部分按照GB/T 1.12009给出的规则起草。 本部分代替DB22/T 396-2014保健用品毒理学评价程序与检

3、验方法，与DB22/T 396-2014相比，结构做了较大调整。除编辑性修改外，主要技术变化如下： 增加了警示； 增加了范围； 修改了仪器与设备。 本部分由吉林省卫生与计划生育委员会提出并归口。 本部分起草单位：吉林省疾病预防控制中心。 本部分主要起草人：张晶莹、孙兰、宋昕恬、孟令仪、隋自洁、高峰、吴晓刚。 本部分所代替标准的历次版本发布情况为： DB22/T 396-2004； DB22/T 396-2014。 DB22/T 396.102017 1 保健用品毒理学评价程序与检验方法 第 10 部分：致畸试验 警示使用本标准的人员应有正规实验室工作的实践经验。本标准并未指出所有可能的安全问题

4、。使用者有责任采取适当的安全和健康措施，并保证符合国家有关法规规定的条件。 1 范围 本标准规定了保健用品毒理学致畸试验评价程序。 本标准适用于保健用品毒理学致畸试验检验方法。 2 致畸试验方法 2.1 试剂及其配制（实验用水为纯水） 2.1.1 甲醛、冰乙酸、2,4,6-三硝基酚、氢氧化钾、甘油、水合氯醛、茜素红； 2.1.2 茜素红贮备液：茜素红-S，50 %乙酸饱和液 5.0 mL，甘油 10.0 mL，1%水合氯醛溶液 60.0 mL混合，放入棕色瓶中； 2.1.3 茜素红应用液：取贮备液 3 mL5 mL，用 1 g/100 mL2g/100 mL 氢氧化钾液稀释至 l000 mL，

5、存于棕色瓶中； 2.1.4 透明液 A：甘油 200 mL、氢氧化钾 10 g、蒸馏水 790 mL 混合； 2.1.5 透明液 B：甘油与蒸馏水等量混合； 2.1.6 固定液：Bouins 液：2,4,6-三硝基酚 75 份、甲醛 20 份、冰乙酸 5 份。 2.2 仪器与设备 2.2.1 分析天平：精确度为 0.1 g； 2.2.2 生物显微镜； 2.2.3 体视显微镜； 2.2.4 游标卡尺（百分尺）。 2.3 实验动物 常用试验动物为大鼠、小鼠和家兔。传统致畸应选用健康性成熟(90 d100 d)雌、雄大鼠，雌性应为未交配过的大鼠80 只90 只。雄鼠减半。 2.4 剂量分组 至少设四

6、个组，一个空白对照组，3个试验组。剂量原则上可采用1/4、1/16、l/64 LD50，或以长期毒性试验的最大无作用剂量为高剂量组，其1/30左右为低剂量组，在其间设一组。对某种新的动物，初次试验可设一阳性对照组。每组至少12 只孕鼠。常用阳性对照物有敌枯双（0.5 mg/kg1.0 mg/kg体重）、五氯酚钠阿斯匹林(30 mg/kg体重)及维生素A 25000 IU40000 IU等。 2.5 操作步骤 DB22/T 396.102017 2 2.5.1 “受孕动物”的检查和给受试物时间 性成熟雌、雄大鼠按 1:1(或2:1)同笼后，每日早晨观察阴栓（或阴道涂片），查出阴栓(或精子)，认为

7、该鼠以交配，当日作为“受孕”零天。如果5 d内未交配，应更换雄鼠。检出的“孕鼠”随机分到各组，并称重和编号，在受孕的第7 d16 d，每天经皮给予受试物。受孕的0 d、7 d、12 d、16 d、20 d称体重，并计算给受试物的量。动物交配期室温在20 25 为宜，环境安静，必要时给予增加麦芽和蛋糕等营养物质。 2.5.2 孕鼠处死和检查 大鼠于妊娠20 d，小鼠第18 d，兔第29 d处死。大鼠用2 g/l00 mL硫喷妥钠1 mL/只1.5 mL/只腹腔注射，麻醉或直接断头。剖腹取出子宫称重，记录并检查胚胎、着床数、早期吸收胎，迟死胎及活胎数。 2.5.3 活胎鼠检查 逐一记录胎仔体重、体

8、长、检查胎鼠外观有无异常，如头部有无脑膨出、露脑、小头、小耳、小眼、无眼和睁眼、兔唇、下颌裂、躯干部有无腹壁裂、脐疝、脊柱弯曲，四肢有无小肢、短肢、并趾、无趾等，尾部有无短尾、卷尾、无尾，肛门有无闭锁。 2.5.4 胎鼠骨标本的制作与检查 将每窝1/2的活胎（奇数或偶数）放入95%（V/V）乙醇中固定2周3周，取出胎仔（或可去皮、去内脏及脂肪）流水冲洗数分钟后放入1 g/l00 m12 g/l00 m1的氢氧化钾溶液内（至少5倍于胎仔体积）8 h72 h，透明后放入茜素红-S应用液中染色6 h48 h，并轻摇1 次/d2 次/d，至头骨染红为宜。再放入透明液A中1 d2 d，放入透明液B中2

9、d3 d，待骨骼染红而软组织基本褪色，将标本放入小平皿中，用透射光源，在体视显微镜下作整体观察，然后逐步检查骨骼。测量囟门大小、矢状缝的宽度、头顶间骨及后头骨缺损情况，然后检查胸骨的数目，缺失或融合（胸骨为6 个，骨化不全时首先缺第5胸骨、次为缺第2胸骨）。肋骨通常12 对13 对，常见畸形有融合肋、分叉肋、波状肋、短肋、多肋、缺肋、肋骨中断。脊柱发育和椎体数目(颈椎7 个，胸椎12 个13 个，腰椎5 个 6 个，底椎4 个，尾椎3 个5 个)有无融合、纵裂等最后检查四肢骨。 2.5.5 胎鼠内脏检查 每窝的1/2胎鼠放人Bouins液中，固定两周后作内脏检查。先用自来水冲去固定液，将鼠仰放

10、在石蜡板上，剪去四肢和尾，用刀片从头部到尾部逐段横切或纵切。按不同部位的断面观察器官的大小、形状和相对位置。正常切面见图1。 图1 正常切面图 DB22/T 396.102017 3 观察步骤： a) 经口从舌与两口角向枕部横切（切面 1），可观察大脑、间脑、正脑、舌及颚裂； b) 在眼前面作垂直纵切（切面 2）、可见鼻部； c) 从头部垂直通过眼球中央作纵切（切面 3），沿头部最大横位处穿过脑作切面(切面 4)，可观察舌裂、颚裂、眼球畸形、脑和脑室异常； d) 沿小颚水平通过颈部作横（切面 5），可观察气管、食管和延脑或脊髓，以后自腹中线剪开胸、腹腔，依次检查心、肺、横隔膜、肝、胃肠等脏器的

11、大小、位置，查毕将其摘除，再检查肾脏、输尿管、膀胱、子宫或睾丸位置及发育情况。然后将肾脏切开，观察有无肾孟积水与扩大。 2.6 结果评价 各种率的检查用X2检验，孕鼠增重用方差分析或非参数统计，胎鼠身长、体重、窝平均活胎数用T检验。结果应能得到受试物是否有母体毒性和胚胎毒性、致畸性，最好能得出最小致畸剂量。为比较不同有害物质的致畸强度，可计算致畸指数，暂以致畸指数10以下为不致畸，10100为致畸，100以下为强致畸。为表示有害物质在保健用品中存在时人体受害机率，可计算致畸危害指数，如指数大于300说明该物对人危害小，100300为中等，小于100为大。 mki =. (1) 式中： i致畸指数； k雌鼠LD50； m最小致畸剂量，g。 21mmk =. (2) 式中： k致畸危害指数； 1m最大不致畸剂量，g； 2m最大可能摄入量，g。 _